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發(fā)布時(shí)間： 2017-10-30 點(diǎn)擊次數(shù)： 1578次ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，本法不僅可以用來(lái)測(cè)定抗體，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個(gè)方面：
1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。
2、研究抗酶抗體的合成。
3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。
4、定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份。
操作流程如下：
（1）待測(cè)樣品孔中每孔加入待測(cè)樣品100μl，每種樣品設(shè)3個(gè)平行孔；設(shè)兩個(gè)陰性對(duì)照孔，每孔加未處理組的細(xì)胞裂解液100μl；另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔，加入純細(xì)胞裂解液100μl。 （2）酶標(biāo)板置4℃，包被。
（3）洗板：吸干孔內(nèi)反應(yīng)液，用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去），之后將洗滌液注滿板孔，浸泡1-2分鐘，間歇搖動(dòng)。甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干。重復(fù)洗滌3-4次。
（4）陰性對(duì)照孔每孔加入PBS 50μl，樣品孔及空白孔每孔加入1：500稀釋的兔抗人AIF抗體工作液50μl。
（5）酶標(biāo)板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi)，孵育60min。
（6）洗板，同（4）。
（7）每孔加1：5000稀釋的HRP-標(biāo)記的山羊抗兔抗體工作液 100μl。
（8）酶標(biāo)板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi)，孵育60min。
（9）洗板，同（4）。
（10）每孔加TMB顯色液 100μl，輕輕混勻10s，置37℃暗處反應(yīng)15-20min。
（11）每孔加100μl 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。
（12）分別測(cè)450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2，zui終測(cè)得的OD值為兩者之差（W1-W2），以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
（13）數(shù)據(jù)處理：在得出標(biāo)本（S）和陰性對(duì)照（N）的 OD值后，計(jì)算S/N值。S/N≥2.1為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。
注：所用溶液配方
(1) PBS：稱取0.2g KH2P04, 2.9g Na2HP04?12H20、8.0g NaCl, 0.2g KCl，加雙蒸水至1000ml。
（2）包被緩沖液：稱取1.59g Na2CO3, 2.938 NaHCO3，加雙蒸水至 1000m1。
（3）洗滌液(PBST)：含0.05% Tween-20的PBS。
（4）稀釋液：含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS，主要用以稀釋抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品。
（5）TMB顯色液：稱取1.84g Na2HP04.12H20, 0.51 g檸檬酸，加雙蒸水至1O0ml，配成檸檬酸-磷酸緩沖溶液。用10.5 ml 檸檬酸-磷酸緩沖溶液溶解1錠TMB，再加入35μl 3% H2O2
（6）細(xì)胞裂解液：1% TritonX-100，137mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，1mmol/L PMSF，pH 7.4。（其中PMSF溶于異丙醇中，配成1O mmo/L，-20℃ 貯存?zhèn)溆谩?/p>