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發(fā)布時(shí)間： 2014-05-08 點(diǎn)擊次數(shù)： 1299次1、ELISA試劑盒的準(zhǔn)備
按ELISA試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測(cè)量較正。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。
2、保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當(dāng)。
ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。ELISA試劑盒在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中夜，以形成zui多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(zhǎng)，在ELISA中一般不予采用。保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。
ELISA試劑盒使用注意事項(xiàng)
1、試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5)時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
2、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫(20～25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
3、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
4、每加一種試劑前需將其搖勻。
5、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色時(shí)間為15～20min即可。若顏色較淺，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到30min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。
6、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
7、不要使用過了有效日期的ELISA試劑盒;也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的ELISA檢測(cè)試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低;不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
當(dāng)然除了注意以上幾點(diǎn)外，選對(duì)ELISA試劑盒也很關(guān)鍵，可以大大降低實(shí)驗(yàn)危險(xiǎn)性，本公司的
ELISA試劑盒具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相載體;
二、穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性;
三、、靈敏、特異的抗體;
四、節(jié)省實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。
五、適用血清、血漿、組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標(biāo)本類型;