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miRNA定量及均一化cDNA文庫(kù)技術(shù)
發(fā)布時(shí)間： 2011/9/23 點(diǎn)擊次數(shù)： 1281次提 供 商： 研域（上海）化學(xué)試劑有限公司 資料大小： 圖片類型： 下載次數(shù)： 295 次 資料類型： DOC 瀏覽次數(shù)： 1281 次 相關(guān)產(chǎn)品： 詳細(xì)介紹： 文件下載 進(jìn)行一次逆轉(zhuǎn)錄即可實(shí)現(xiàn)所有目標(biāo)miRNA的測(cè)定？沒(méi)錯(cuò)，采用加尾法，一次逆轉(zhuǎn)錄就可以得到全部miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA。
我們知道，真核生物mRNA都是有poly-A尾巴的，這樣Oligo-dT（逆轉(zhuǎn)錄引物）就很容易結(jié)合到mRNA上來(lái)合成cDNA了。
miRNA就缺了poly-A尾巴，怎么辦呢？在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中加入poly-A聚合酶，先給它們加上一串poly-A尾巴，然后用帶有一段通用序列的Oligo-dT和逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)合成cDNA。這樣一來(lái)，一次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)就合成了所有miRNA以及其他snRNA、mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA，接下來(lái)想用來(lái)檢測(cè)什么都可以！
您只需要提供1μg合格的total RNA，就可以對(duì)所有感興趣的miRNA進(jìn)行檢測(cè)。這既可避免莖環(huán)法（各目標(biāo)miRNA單獨(dú)逆轉(zhuǎn)錄）帶來(lái)的逆轉(zhuǎn)錄效率、加樣誤差等方面的影響，還可節(jié)約多條特異逆轉(zhuǎn)錄引物和多次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的花費(fèi)，可謂一舉兩得，何樂(lè)而不為？
均一化cDNA文庫(kù)
基因轉(zhuǎn)錄水平上的巨大差異常常給文庫(kù)篩選和分析帶來(lái)障礙，采用均一化文庫(kù)技術(shù)可有效克服這一問(wèn)題。 均一化 cDNA 文庫(kù)具有以下4方面的優(yōu)點(diǎn)：*，在經(jīng)濟(jì)上具有廣泛的應(yīng)用空間，可以節(jié)約大量試驗(yàn)成本。第二，增加克隆低豐度 mRNA 的機(jī)會(huì)，適用于分析各種發(fā)育階段或各種組織的基因表達(dá)及突變檢測(cè)。第三，與原始豐度的 mRNA 拷貝數(shù)相對(duì)應(yīng)的 cDNA 探針與均一化的 cDNA 文庫(kù)作雜交，可以估計(jì)出大多數(shù)基因的表達(dá)水平及發(fā)現(xiàn)一些組織特異的基因。而以往的文庫(kù)構(gòu)建，忽略了 mRNA 豐度的影響。第四，可以用于遺傳圖譜的制作和進(jìn)行大規(guī)模的原位雜交，作為優(yōu)化的文庫(kù)系統(tǒng)還可以用于大規(guī)模的測(cè)序。
現(xiàn)在，在構(gòu)建均一化的 cDNA 文庫(kù)中至少有2種主要的觀點(diǎn)：一種是基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)的原理，高豐度的 cDNA 在退火條件下復(fù)性的速度快，而低豐度的 cDNA 復(fù)性要很長(zhǎng)時(shí)間，從而可以通過(guò)控制復(fù)性時(shí)間來(lái)降低豐度；另一種是基于基因組 DNA 在拷貝數(shù)上具有相對(duì)均一化的性質(zhì)，通過(guò) cDNA 與基因組 DNA 飽和雜交而降低在文庫(kù)中高拷貝存在的 cDNA 的豐度。*種方法的掌握對(duì)技術(shù)的要求比較高，對(duì)多數(shù)人而言需要多次摸索才能找到zui適條件；而后一種方法易于掌握，但有研究者根據(jù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)的原理也提出了其不利因素，即采用基因組 DNA 飽和雜交的方法會(huì)因?yàn)榈涂截惖谋磉_(dá)基因拷貝數(shù)少而無(wú)法被雜交上。
DSN （duplexspecificenzyme） 是zui近發(fā)現(xiàn)的一種熱穩(wěn)定核酸酶（Shagin ., 2002）。該酶能夠選擇性降解雙鏈 DNA 和 DNARNA雜交體中的 DNA，對(duì)單鏈核酸分子幾乎沒(méi)有作用。同目前常用的均一化技術(shù)相比，基于 DSN 的均一化技術(shù)操作步驟簡(jiǎn)單， 所需要的起始材料也比較少， 具有較好的應(yīng)用前景。
上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司開(kāi)展miRNA定量檢測(cè)服務(wù)已經(jīng)近三年時(shí)間，服務(wù)項(xiàng)目幾百個(gè)。擁有自己的miRNA引物庫(kù)（人類），對(duì)其他物種可以自行設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)樣品范圍廣，包括：細(xì)胞、組織、血液、血漿、血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清等，操作規(guī)范，時(shí)間可控，為廣大研究工作者提供了良好的便利。
同時(shí)，其作為國(guó)內(nèi)cDNA文庫(kù)構(gòu)建的主流服務(wù)供應(yīng)商，在長(zhǎng)期穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)服務(wù)過(guò)程中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)成功構(gòu)建包括動(dòng)物、植物、細(xì)菌等幾十個(gè)物種的cDNA文庫(kù)。他們基于雙鏈特異性核酸酶（Duplex-Specific Nuclease, DSN）的先進(jìn)cDNA文庫(kù)均一化技術(shù)，能減低高豐度表達(dá)基因100倍以上，有效富集低豐度表達(dá)基因，從而降低冗余率。