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    miRNA定量及均一化cDNA文庫技術

    發布時間: 2011/9/23  點擊次數: 1103次
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    進行一次逆轉錄即可實現所有目標miRNA的測定?沒錯,采用加尾法,一次逆轉錄就可以得到全部miRNA對應的cDNA。

    我們知道,真核生物mRNA都是有poly-A尾巴的,這樣Oligo-dT(逆轉錄引物)就很容易結合到mRNA上來合成cDNA了。

    miRNA就缺了poly-A尾巴,怎么辦呢?在逆轉錄試劑盒中加入poly-A聚合酶,先給它們加上一串poly-A尾巴,然后用帶有一段通用序列的Oligo-dT和逆轉錄酶來合成cDNA。這樣一來,一次逆轉錄反應就合成了所有miRNA以及其他snRNA、mRNA對應的cDNA,接下來想用來檢測什么都可以!

    您只需要提供1μg合格的total RNA,就可以對所有感興趣的miRNA進行檢測。這既可避免莖環法(各目標miRNA單獨逆轉錄)帶來的逆轉錄效率、加樣誤差等方面的影響,還可節約多條特異逆轉錄引物和多次逆轉錄反應的花費,可謂一舉兩得,何樂而不為?

    均一化cDNA文庫

    基因轉錄水平上的巨大差異常常給文庫篩選和分析帶來障礙,采用均一化文庫技術可有效克服這一問題。 均一化 cDNA 文庫具有以下4方面的優點:*,在經濟上具有廣泛的應用空間,可以節約大量試驗成本。第二,增加克隆低豐度 mRNA 的機會,適用于分析各種發育階段或各種組織的基因表達及突變檢測。第三,與原始豐度的 mRNA 拷貝數相對應的 cDNA 探針與均一化的 cDNA 文庫作雜交,可以估計出大多數基因的表達水平及發現一些組織特異的基因。而以往的文庫構建,忽略了 mRNA 豐度的影響。第四,可以用于遺傳圖譜的制作和進行大規模的原位雜交,作為優化的文庫系統還可以用于大規模的測序。

    現在,在構建均一化的 cDNA 文庫中至少有2種主要的觀點:一種是基于復性動力學的原理,高豐度的 cDNA 在退火條件下復性的速度快,而低豐度的 cDNA 復性要很長時間,從而可以通過控制復性時間來降低豐度;另一種是基于基因組 DNA 在拷貝數上具有相對均一化的性質,通過 cDNA 與基因組 DNA 飽和雜交而降低在文庫中高拷貝存在的 cDNA 的豐度。*種方法的掌握對技術的要求比較高,對多數人而言需要多次摸索才能找到zui適條件;而后一種方法易于掌握,但有研究者根據復性動力學的原理也提出了其不利因素,即采用基因組 DNA 飽和雜交的方法會因為低拷貝的表達基因拷貝數少而無法被雜交上。

    DSN (duplexspecificenzyme) 是zui近發現的一種熱穩定核酸酶(Shagin ., 2002)。該酶能夠選擇性降解雙鏈 DNA 和 DNARNA雜交體中的 DNA,對單鏈核酸分子幾乎沒有作用。同目前常用的均一化技術相比,基于 DSN 的均一化技術操作步驟簡單, 所需要的起始材料也比較少, 具有較好的應用前景。

    上海歐易生物醫學科技有限公司開展miRNA定量檢測服務已經近三年時間,服務項目幾百個。擁有自己的miRNA引物庫(人類),對其他物種可以自行設計引物,檢測樣品范圍廣,包括:細胞、組織、血液、血漿、血清、細胞培養上清等,操作規范,時間可控,為廣大研究工作者提供了良好的便利。

    同時,其作為國內cDNA文庫構建的主流服務供應商,在長期穩定的實驗服務過程中積累了豐富的經驗,已經成功構建包括動物、植物、細菌等幾十個物種的cDNA文庫。他們基于雙鏈特異性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease, DSN)的先進cDNA文庫均一化技術,能減低高豐度表達基因100倍以上,有效富集低豐度表達基因,從而降低冗余率。
     

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