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    微載體培養原理

    發布時間: 2011/5/13  點擊次數: 1135次
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    微載體培養原理
     

     1.原理:

    其原理是將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養容器的培養液中,作為載體,使細胞在微載體表面附著生長,同時通過持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。

    貼壁依賴性細胞在微載體表面上的增殖,要經歷黏附貼壁、生長和擴展成單層三個階段。細胞只有貼附在固體基質表面才能增殖,故細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細胞能否在微載體表面黏附,主要取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。

    2. 攪拌轉速:

    由于動物細胞無細胞壁,對剪切力敏感,因而無法靠提高攪拌轉速來增加接觸概率。通常的操作方式是:在貼壁期采用低攪拌轉速,時攪時停;數小時后,待細胞附著于微載體表面時,維持設定的低轉速,進入培養階段。微載體培養的攪拌非常慢,zui大速度75r/min。

    3.細胞與微載體的相融性,是與微載體表面理化性質有關。一般細胞在進入生理PH值時,表面帶負電荷。若微載體帶正電荷,則利用靜電引力可加快細胞貼壁速度。若微載體帶負電荷,因靜電斥力使細胞難于黏附貼壁,但培養液中溶有或微載體表面吸附著二價陽離子作為媒介時,則帶負電荷的細胞也能貼附。

    4. 細胞在微載體表面的生長 影響細胞在微載體表面生長的因素很多,主要有三個方面:

    ●在細胞方面,如細胞群體、狀態和類型。

    ●在微載體方面,如微載體表面狀態、吸附的大分子和離子;微載體表面光滑時細胞擴展快,表面多孔則擴展慢。

    ●在培養環境中,如培養基組成、溫度、pH、DC以及代謝廢物等均明顯影響細胞在微載體上的生長。如果所處條件*,則細胞生長快;反之生長速度慢。

    5. 微載體培養操作要點

    ●培養初期:保證培養基與微球體處于穩定的PH與溫度水平,接種細胞(對數生長期,而非穩定期)至終體積1/3的培養液中,以增加細胞與微載體接觸的機會。不同的微載體所用濃度及接種細胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微載體含量,更高的微載體濃度需要控制環境或經常換液。

    ●貼壁階段(3-8d)后,緩慢加入培養液至工作體積,并且增加攪拌速度保證*均質混合。

    ●培養維持期:進行細胞計數(胞核計數)、葡萄糖測定及細胞形態鏡檢。隨意細胞增殖,微球變得越來越重,需增加攪拌速率。經過3d左右,培養液開始呈酸性,需換液:停止攪拌,讓微珠沉淀5min,棄掉適宜體積的培養液,緩慢加入新鮮培養液(37℃),重新開始攪拌。

    ●收獲細胞:首先排干培養液,至少用緩沖液漂洗1遍,然后加入相應的酶,快速攪拌(75-125r/min)20-30min。然后解離收集細胞及其產品。

    ●微載體培養的放大:可以通過增加微載體的含量或培養體積進行放大。使用異倍體或原代細胞培養生產疫苗、干擾素,已被放大至4000L以上。

     

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