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人腫瘤壞死因子a（TNF-a）ELISA 檢測(cè)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間： 2010/8/14　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2001次

提供商：	研域（上海）化學(xué)試劑有限公司	資料大小：
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詳細(xì)介紹：

人腫瘤壞死因子a（TNF-a）ELISA 檢測(cè)試劑盒

本試劑僅供研究使用標(biāo)本：血清或血漿

試驗(yàn)原理：

TNF-α試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知TNF-α濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將TNF-α和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中TNF-α的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制

試劑盒成份（2-8℃保存）	96孔配置	48孔配置	配制
96/48人份酶標(biāo)板	1塊板（96T）	半塊板（48T）	即用型
塑料膜板蓋	1塊	半塊	即用型
標(biāo)準(zhǔn)品：400pg/ml	1瓶（0.6ml）	1瓶（0.3ml）	按說明書進(jìn)行稀稀
空白對(duì)照	1瓶（1.0ml）	1瓶（0.5ml）	即用型
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液	1瓶（5ml）	1瓶（2.5ml）	即用型
生物素標(biāo)記的抗TNF-α抗體	1瓶（6ml）	1瓶（3.0ml）	即用型
親和鏈酶素-HRP	1瓶（10ml）	1瓶（5.0ml）	即用型
洗滌緩沖液	1瓶（20ml）	1瓶（10ml）	按說明書進(jìn)行稀釋
底物A	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）	即用型
底物B	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）	即用型
終止液	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）	即用型

自備材料

1．蒸餾水。

2．加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3．振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性

1．避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請(qǐng)盡快用水沖洗。

2．實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項(xiàng)

1．試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

2．實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

3．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

4．使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6．洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

7．底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。

8．加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。

9．按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法

1、血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測(cè)。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測(cè)前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準(zhǔn)備

1．標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備，不能儲(chǔ)存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行：

400 pg/ml	（6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
200 pg/ml	（5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
100 pg/ml	（4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
50 pg/ml	（3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
25 pg/ml	（2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
12.5 pg/ml	（1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0 pg/ml	（空白對(duì)照）	原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2．洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟

1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2．根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。

3．加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時(shí)。

4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。

8．取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。

9．在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

建議使用的實(shí)驗(yàn)方案

標(biāo)準(zhǔn)品濃度（pg/ml）

400

樣品

200

樣品

100

樣品

12.5

樣品

局限

6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果。

試劑盒性能

1. 靈敏度：zui小的檢測(cè)濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。

3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

結(jié)果判斷 與分析

1、儀器值：于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的TNF-α含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

3、檢測(cè)值范圍：0-400pg/ml

4、敏感度： 1.0 pg/ml

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