12-氧-植物二烯酸還原酶酶聯免疫分析（ELISA）

發布時間： 2017/3/17　　點擊次數： 1162次

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試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用
目的：本試劑盒用于測定相關樣本中12-氧-植物二烯酸還原酶（OPR）含量。
12-氧-植物二烯酸還原酶（OPR）酶聯免疫分析實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中12-氧-植物二烯酸還原酶（OPR）水平。用純化的12-氧-植物二烯酸還原酶（OPR）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入12-氧-植物二烯酸還原酶（OPR）抗原，再與HRP標記的12-氧-植物二烯酸還原酶（OPR）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的12-氧-植物二烯酸還原酶（OPR）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中12-氧-植物二烯酸還原酶（OPR）濃度。
試劑盒組成：

標本要求：
1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟：
1.標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在*、第二孔中分別加標準品100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為150ng/L，100ng/L ，50ng/L，25ng/L，12.5ng/L）。
2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。
5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7.溫育：操作同3。
8.洗滌：操作同5。
9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉）。
11.測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
注意事項：
1．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
12-氧-植物二烯酸還原酶（OPR）酶聯免疫分析計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，
在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD
值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋
倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值
代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋
倍數，即為樣品的實際濃度。
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。
2.批內與批見應分別小于9%和11%
檢測范圍：
6ng/L -200ng/L
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月

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